CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.024

畜牧兽医学报 ›› 2016, Vol. 47 ›› Issue (6): 1266-1271.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.024

CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

左其生，王颖洁，赵瑞丰，程少泽，汪怡临，靳锴，王飞，纪艳芹，路镇宇，张文慧，张亚妮^*，李碧春^*

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009）

收稿日期:2015-10-08 出版日期:2016-06-23 发布日期:2016-06-23
通讯作者: 李碧春，教授，博士，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn；张亚妮，副教授，博士，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cn
作者简介:左其生（1992-），男，江苏盐城人，博士生，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：744366503@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金（31301959；31272429；31472087）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20123250120009）；中国博士后基金（2012M511326；2014T70550）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；大学生创新创业训练计划项目（201411117033Z）

CRISPR/Cas Techniques Can Knockout the Gene of Chicken Effectively

ZUO Qi-sheng，WANG Ying-jie，ZHAO Rui-feng，CHENG Shao-ze，WANG Yi-lin，JIN Kai，WANG Fei，JI Yan-qin，LU Zhen-yu，ZHANG Wen-hui，ZHANG Ya-ni^*，LI Bi-chun^*

（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

Received:2015-10-08 Online:2016-06-23 Published:2016-06-23

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系，实现目的基因定点敲除，为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2，Expression In PGC) 基因全长，并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3，并构建cas9/gRNA载体；将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1，利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明，只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性，荧光活性比对照组高两倍，T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%，TA克隆测序结果表明，30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加，初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术，该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。

Abstract:

This study aimed to establish a highly efficient and stable gene editing technique mediated by CRISPR/Cas to knock out the targeted gene，and explore its application in chicken preliminarily，and to provide the operation basis for the subsequent poultry genetic edition.We cloned the full-length of C2EIP (chr2，Expression in PGC) gene according to sequence in NCBI Database，and designed 3 gRNAs named gRNA1，gRNA2 and gRNA3 based on the location of APM in the sequence to construct the cas9/gRNA vector.SSA activity assay，T7E1 digestion method and sequencing of TA cloning were used to detect the knock-out efficiency of the gRNA after the cas9/gRNA vector transfected into DF-1.Results of SSA activity assay showed that only cas9/gRNA3 vector could knock out the gene effectively，fluorescence activity which transfected cas9/gRNA3 was twice higher than the control group；Result of T7E1 digestion showed that activity of cas9/gRNA3 was 27%，sequencing of TA cloning results showed there were 8 mutational samples in 30 samples，and the efficiency of gene-knockout was 26%.In this study we established the technology of gene knockout mediated by CRISPR/Cas in chicken，which can be used to konck out genes in DF-1 stably.

中图分类号:

S831.2

左其生，王颖洁，赵瑞丰，程少泽，汪怡临，靳锴，王飞，纪艳芹，路镇宇，张文慧，张亚妮，李碧春. CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1266-1271.

ZUO Qi-sheng，WANG Ying-jie，ZHAO Rui-feng，CHENG Shao-ze，WANG Yi-lin，JIN Kai，WANG Fei，JI Yan-qin，LU Zhen-yu，ZHANG Wen-hui，ZHANG Ya-ni，LI Bi-chun. CRISPR/Cas Techniques Can Knockout the Gene of Chicken Effectively[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2016, 47(6): 1266-1271.

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参考文献

［1］PAIN B，CLARK M E，SHEN M，et al.Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities［J］.Development，1996，122(8)：2339-2348.
［2］LI B，SUN G，SUN H，et al.Producing transgenic chicken in swarm mediated by spermatogonial stem cells in vivo and in vitro［J］.Science in China，2008，38(7)：626-634.
［3］MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9［J］.Science，2013，339(6121)：823-826.
［4］CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］.Science，2013，339(6121)：819-823.
［5］JIANG W，BIKARD D，COX D，et al.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems［J］.Nat Biotechnol，2013，31(3)：233-239.
［6］HSU P D，LANDER E S，ZHANG F.Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering［J］.Cell，2014，157(6)：1262-1278.
［7］WU Y，LIANG D，WANG Y，et al.Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9［J］.Cell Stem Cell，2013，13(6)：659-662.
［8］SCHWANK G，KOO B K，SASSELLI V，et al.Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients［J］.Cell Stem Cell，2013，13(6)：653-658.
［9］FU Y，FODEN J，KHAYTER C，et al.High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells［J］.Nat Biotechnol，2013，31(9)：822-826.
［10］LI D，QIU Z，SHAO Y，et al.Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system［J］. Nat Biotechnol，2013，31(8)：681-683.
［11］HWANG W Y，FU Y，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31(3)：227-229.
［12］XIAO A，WANG Z，HU Y，et al.Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish［J］.Nucleic Acids Res，2013，41(14)：e141.
［13］SHAN Q，WANG Y，LI J，et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31(8)：686-688.
［14］ZHANG Z，ELSAYED A K，SHI Q，et al.Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation［J］.J Biol Chem，2015，290(21)：13605-13621.
［15］JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］.Science，2012，337(6096)：816-821.
［16］JINEK M，JIANG F，TAYLOR D W，et al.Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation［J］.Science，2014，343(6176)：1247997.
［17］CHO S W，KIM S，KIM J M，et al.Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease［J］.Nat Biotechnol，2013，31(3)：230-232.
［18］CHO S W，KIM S，KIM Y，et al.Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases［J］.Genome Res，2014，24(1)：132-141.
［19］YANG H，WANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］.Cell，2013，154(6)：1370-1379.

[1]	唐鑫鑫, 郑炬梅, 骆娜, 营凡, 朱丹, 李森, 刘大伟, 安炳星, 文杰, 赵桂苹, 李和刚. 基于全基因组关联分析揭示肉鸡腿病发生的遗传机制[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(1): 99-109.
[2]	徐小静, 董瑞玲, 魏立民, 赵少猛, 赵桂苹, 张敏红, 冯京海. 文昌鸡母鸡生长模型的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4952-4961.
[3]	齐丽娜, 陆雪林, 杨凯旋, 周瑾, 李先玉, 刘珂, 张文刚, 顾欣, 章伟建. 基于SNP芯片分析新浦东鸡的遗传多样性和遗传结构[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4962-4971.
[4]	王燕星, 张雨时, 姬海港, 刘阳, 牛玉芳, 韩瑞丽, 刘小军, 田亚东, 康相涛, 李转见. 鸡骨骼肌卫星细胞系的建立及分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4972-4981.
[5]	范晨宇, 单艳菊, 章明, 姬改革, 巨晓军, 屠云洁, 贺喜, 束婧婷, 刘一帆, 张海涵. 立华麻黄鸡体重和肉品质性状全基因组关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4982-4992.
[6]	陈诚, 乔西波, 孙亿, 康丽, 姜运良. 琅琊鸡FSHR基因-868位点的多态性及对产蛋性能的遗传效应研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4560-4568.
[7]	金四华, 贾富民, 何培莉, 贾羽晴, 税斐, 刘旭玲, 刘星, 王新, 徐嫚, 耿照玉. IHH过表达对鸡原代软骨细胞增殖和分化的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4569-4576.
[8]	陈雪娇, 刘会杰, 臧蕾, 冯静, 鹏达, 张浩. 鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4154-4163.
[9]	张寅梁, 岳巧娴, 黄晨轩, 陈辉, 王德贺, 周荣艳. 产蛋初期和后期蛋鸡胫骨转录谱的构建及骨代谢相关基因分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4164-4173.
[10]	郑钢, 连玲. 鸡性别决定及分化关键调控基因DMRT1研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3152-3163.
[11]	白露, 王梦杰, 马小春, 何政肖, 谭晓冬, 刘杰, 赵桂苹, 文杰, 刘冉冉. 一种快速挖掘鸡品种特征性SNP标记集合的方法[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3252-3261.
[12]	陈春, 康昭风, 魏岳, 黎观红, 武艳平, 谢金防. Wnt3a基因多态性与崇仁麻鸡皮肤毛囊性状相关性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(7): 2810-2823.
[13]	刘航, 王欢欢, 葛莹, 张雷, 张伟武, 魏莹晖, 李庆海, 范京辉, 章学东. 基于转录组和蛋白组筛选乌骨鸡肤色性状候选基因[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2320-2329.
[14]	王辉, 许梦缘, 刘灵康, 郑喜邦, 李恭贺, 吴文德. PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2330-2342.
[15]	王政, 郭文婕, 程瑾, 原一桐, 罗榕, 薛毅, 张利环, 朱芷葳, 李慧锋. 营养转运相关基因调控区多态性与黄羽肉鸡饲料转化率关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2343-2352.

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